Projekte des Labors "Signaling mechanisms in brain development and disease"
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Regulierung des PTEN-Tumorsuppressors in Neuronen
PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10) ist ein Tumorsuppressor, der das Proliferations- und Migrationsverhalten verschiedener Zelltypen reduziert und auch Zellwachstum und Zelltod kontrolliert. Die enzymatische Aktivität von PTEN beinhaltet hauptsächlich eine Lipid-Phosphataseaktivität, durch die Phosphatidylinositol 3,4,5-Trisphosphat (PIP3) in Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphonat umwandelt und damit direkt die Aktivität von PI3K und nachgeschalteten Signalübertragungswegen antagonisiert werden (z. B. in der Regulierung des Zytoskeletts und des Translationsapparats). Neuere Arbeiten weisen darauf hin, dass die Deregulierung von PTEN wichtige neuronale Funktionen im Gehirn, beeinträchtigt, was auf eine Rolle bei der Kontrolle des neuronalen Wachstums, der Synaptogenese und synaptischen Plastizität zurückgeführt wird. Unsere Arbeit identifizierte, dass funktionalen Aktin-abhängige Motorproteine die PI3K-Signaltransduktion regulieren kann - ein Mechanismus, der eine bislang unbekannte Verbindung zwischen PTEN und Klasse-V-Myosinen beinhaltet. Wir demonstrierten, dass die Deaktivierung der MyosinV-Transportfunktion der in Neuronen das neuronale Soma vergrößerte und die PI3K und mTor-Signalübertragung verstärkte. Unsere Daten beschreiben einen neuen myosinbasierten Transportmechanismus, der die Funktion des PTEN-Tumorsuppressors und der PI3K-Signalübertragung reguliert (van Diepen et al., 2009).
Funktionsanalysen des Aktinregulators Drebrin im Nervensystem
Das Aktin-Bindeprotein Drebrin reguliert dynamische Prozesse der Organisation von Aktinfilamente, im Besonderen während des Neuritenwachstums. Außerdem ist Drebrin in den Dendritendornen angereichert, wo es die Dornmorphologie kontrolliert und einen Teil des postsynaptischen Proteinkomplexes darstellt, der die synaptische Übertragung steuert. Ein altersabhängiger Verlust des Drebrin Proteins wurde mit MCI (Mild Cognitive Impairment) in Verbindung gebracht - einem Übergangszustand zwischen dem gesunden Alterungsprozess und milder Demenz. Weiterhing wurde eine Assoziation des starken Verlustes von Drebrin in den Dendritendornen in Alzheimer-und Down-Syndrom-Patienten festgestellt. Somit ist Drebrin ein Kandidat, das bei der irreversiblen Dorndegeneration und fortschreitenden kognitive Defizite eine Rolle spielen könnte. Dennoch bleiben die spezifischen Mechanismen der Regulierung von DBN weitgehend unbekannt. Vor Kurzem haben wir die Interaktion des PTEN-Tumorsuppressors mit DBN beschrieben: PTEN bindet DBN und negativ reguliert die Phosphorylierung von Drebrin (Kreis et al., 2013). Um die genaue Rolle von Drebrin und die Signifikanz der Drebrinphosphorylierung in vivo zu untersuchen, haben wir vor Kurzem konditionale Knockout-Mauslinien etabliert und die laufende Forschung bestätigt Drebrinverlust (Drebrin A und Drebrin E) in Abhängigkeit von Cre. Darüber hinaus haben wir ein schnelles und reversibles System zur Re-Expression exogener Drebrinvarianten auf physiologischem Level entwickelt. Diese "Knockout/Rescue"-Herangehensweise wird uns helfen, Erkenntnisse über die Regulierung von Drebrin zu gewinnen, speziell über die Drebrinregulierung während synaptischer Plastizität und neurologischer Störung.
Kollabierende Wachstumskegel
Wichtige Gestaltwandler im Gehirn: Morphologische Veränderungen der Astrozyten während der Entwicklung und bei Hirntraumata
Astrozyten sind die häufigsten Gliazellen im zentralen Nervensystem (ZNS). In der Vergangenheit wurden sie lange als "bloße Unterstützer" der Neuronen betrachtet. Allerdings zeigen neue Forschungsergebnisse, dass Astrozyten aktiv an einer Vielzahl von Funktionen im ZNS - einschließlich der Synaptogenese, der neuronaler Übertragung und der synaptischen Plastizität - beteiligt sind. Bei Erkrankungen und Verletzungen des Gehirns schützen Astrozyten neuronale Zellen effizient durch die Bildung einer Glianarbe und die damit verbundene Reparatur der Blut-Hirn-Schranke. Ihre fein verzweigte Morphologie, welche die Komplexität der Neurone bei weitem überschreitet, erlaubt es den Astrozyten mit spezialisierten zellulären Strukturen wie Synapsen, Blutgefäßen und anderen Gliazellen zu interagieren und somit ihre vielfältigen Aufgaben zu erfüllen. Mit einer Reihe unterschiedlicher experimenteller Ansätze studieren wir das Zytoskelett der Astrozyten in vitro und in vivo, um die Bedeutung und molekularen Grundlagen ihrer Formveränderungen während der postnatalen Hirnentwicklung und bei traumatischen Hirnverletzungen zu verstehen.
Astrozyt
PI3K und Synapsen: PI3K-Signalübertragung und Dendritendornmorphogenese
Die synaptische Übertragung hängt eng mit der Morphologie der Dendritendornen zusammen. Dendritendornen sind Fortsätze an der Neuronenoberfläche, die den Großteil des exzitatorischen Inputs empfangen. Diese Dornen sind dynamische Strukturen, die ihre Form ständig ändern. Solche Veränderungen in der Morphologie werden direkt durch die Aktivität der Synapsen, durch intrazelluläre Ionenkonzentrationen und durch äußere Faktoren beeinflusst und können große Auswirkungen auf die Funktion der Synapsen einschließlich ihrer Leistungsfähigkeit haben. Die Dornenform wird durch Veränderungen im Zytoskelett kontrolliert, das hauptsächlich aus Aktinfilamenten besteht. Die PI3K-Signalübertragung hat sich von großem Einfluss auf die normale Dornenform während der Dornmorphogenese herausgestellt. So erhöht die Aktivierung der PI3K-Signalübertragung beispielsweise die Länge der Filopodiendornen, umgekehrt reduziert die Inhibition dieses Signalübertragungsweges durch die Überexpression von PTEN sowohl die Dendritendornanzahl als auch die Filopodien. Die nachgeschalteten Signalübertragungseffektoren sind zum Großteil unbekannt. Wir haben Aktin Bindeprotein als neuen PTEN-Interaktor identifiziert, das in den Dendritendornen hochangereichert. Derzeit testen wir, ob diese Protein-Protein-Interaktion sich auf die Regulierung der Aktindynamik auswirkt und ob diese gemeinsam die Form und das dynamische Verhalten der Dendritenfortsätze beeinflussen.
Akt Isoform-spezifische Phosphorylierung in neuronalen Zellen und im Gehirn
Akt ist eine Serin/Threonin-Kinase, die dem PI3K-Signalweg nachgeschaltet ist und für die Regulierung von Zellwachstum, -überleben, -proliferation und -differenzierung entscheidend ist. Die Deregulierung der Akt-Aktivität wurde mit dem Fortschreiten verschiedener Pathologien - z.B. Krebs und neurologischen Entwicklungsstörungen - in Verbindung gebracht. Es existieren drei Isoformen, die von drei Genen kodiert werden: Akt1, Akt2 und Akt3. Die funktionale Signifikanz von Isoformen in der Akt-Signalgebung neuronaler Zellen ist nicht vollständig bekannt. Akt hat drei Hauptphosphorylierungsstellen, zwei aktivierende an S473 und T308 (nummeriert nach Akt1) und eine konstitutive, stabilisierende Phosphorylierung an T450. Western-Blot-Analysen der verschiedenen Phosphorylierungsstellen unter Verwendung von Phospho-spezifischen Antikörpern sind aufgrund der fehlenden Isoform-Spezifität von Antikörpern begrenzt. Wir verwenden isoelektrische Fokussierung (IEF), um Isoform-spezifische Phosphorylierungszustände durch Unterschiede in ihrem isoelektrischen Punkt (pI) zu untersuchen. Die Analyse von Isoformen und individuellen Phosphorylierungszuständen von nativen Proteinen durch IEF erfolgt durch Trennung in Kapillaren mit schneller Immobilisierung, was eine Auflösung und Quantifizierung unter Verwendung eines einzigen Antikörpers ermöglicht.
Wir haben einen Assay für Akt etabliert, um individuelle neuronale Isoformen und ihre spezifische Phosphorylierungen nach Stimulierung mit Wachstumsfaktoren (z. B. Insulin) oder mit PI3K-Inhibitor behandelten Zelllysaten zu identifizieren. Der neu entwickelte Test bietet eine Basis für die schnelle Analyse von der Isoform-spezifischen Akt Phosphorylierung.